蛋白质组学揭示外泌体加速糖尿病人伤口修复
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景杰编者按
在日常生活中，磕磕碰碰总是难免的事情。对于普通人来说，这些软组织损伤处会发生细胞迁移、增殖、血管生成等一系列生物学过程，于是伤口很快便可以痊愈；但是糖尿病人局部血管生成慢，供血少，这些伤口很难愈合，严重时会导致慢性溃疡的发生。因此糖尿病后伤口难以愈合是一个目前尚无法攻克的问题，同样也是组织损伤界的持续热点。如何通过加速血管生成过程促进糖尿病人伤口愈合显得尤为重要。
2016年的一项研究显示外泌体可以促进损伤组织的修复[1]，间充质干细胞来源的外泌体注射到小鼠皮肤损伤处可以显著促进胶原生成，血管重塑。研究者发现尿液中也存在干细胞，如果这些干细胞来源的外泌体也具备创伤修复的功能，那对糖尿病人难以修复的伤口是不是有促进愈合的作用呢？
近期，景杰生物与中南大学湘雅医院“青千”谢辉教授合作发现尿液来源干细胞（USCs,urine-derived stem cells）中的外泌体可以通过促进血管生成从而加速糖尿病人伤口修复[2]，该发现发表在著名的学术期刊Theranostics (IF=8.78)。依靠景杰生物的定量蛋白质组学平台，研究人员利用外泌体以及USCs定量质谱，鉴定出4214个蛋白；通过生物信息学分析发现，差异蛋白主要参与创伤修复等过程，其中促血管生成蛋白（DMBT1）在外泌体中显著上调，表明DMBT1作为一个血管生成促进因子，可能参与到糖尿病人创伤修复的过程中。
关键词：外泌体；尿液来源干细胞；慢性损伤；血管生成；DMBT1
研究思路与结果
首先，作者通过体外实验表明：尿液干细胞来源的外泌体USC-Exos可以促进组织血管的生成。作者从健康人的尿液细胞中分离出干细胞（USC），并且从形态和功能室对其进行了验证。接着将USCs来源的外泌体（USC-Exos）分别取刺激角化细胞和纤维母细胞中，因为这两种细胞对于组织修复有很重要的作用。结果显示USC-Exos可以促进角化细胞和纤维母细胞的增殖、迁移；随后，作者用USC-Exos与血管内皮细胞共培养，结果显示外泌体促成了血管内皮细胞的增殖、迁移及成管。这一系列的研究结果表明：外泌体USC-Exos可以促进组织血管的生成。
接下来，作者利用蛋白质组学技术以研究USC-Exos促进血管生成的机制。作者运用ITRAQ标记的串联质谱技术对USC-Exos以及USC细胞做蛋白质组学分析，研究共检测到4214个蛋白，其中3762个蛋白有定量信息。以1.5倍，p<0.05为阈值分析，发现USC-Exos中有442个蛋白比USCs表达高，有2469个蛋白比USCs表达低。差异蛋白的GO分析表明差异蛋白主要富集在伤口愈合相关的生物过程中，包括细胞增殖、皮肤细胞迁移、分化、血管生成、细胞外基质组装等等（图1）。
图1 差异蛋白GO分析
作者分析发现，USC-Exos中多种血管生成相关蛋白表达上调，其中促血管生成蛋白（DMBT1）上调最为显著（图1B），作者用Western Blot实验验证，同样发现DMBT1在USC-Exos显著上调（图1C）。
为了研究DMBT1对USC-Exos功能的影响，作者设计了三条shRNA敲除USC中的DMBT1。作者用WB实验验证发现，1#shRNA能够敲除USC来源的外泌体中的DMBT1蛋白，该外泌体称为USCsshDMBT1-Exos。CCK8实验显示DMBT1的敲除会影响血管内皮细胞的增殖(图2C)，同时划痕实验和transwell实验发现（图2D,F），DMBT1敲除后，USC-Exos促进细胞迁移的能力下降。
图2 DMBT1敲除影响细胞增殖、迁移
为了研究USC-Exos对糖尿病过程中伤口愈合的作用，以及该过程中DMBT1蛋白的功能，作者构建了糖尿病模型小鼠，并且在小鼠背部构建创伤模型。研究者发现，在创伤处注射USCsCon shRNA-Exos，小鼠创口愈合速度明显高于PBS组（图3A）。但是注射USCsshDMBT1-Exos后，小鼠伤口愈合速度比USCsCon shRNA-Exos慢，表明USC-Exos对糖尿病过程中伤口愈合起到促进作用，而发挥此功能的主要是DMBT1蛋白。
图3 USC-Exos促进糖尿病小鼠伤口愈合
小结
糖尿病人的皮肤损伤往往会发展成为慢性溃疡，同样也是组织损伤界的持续热点。谢辉教授运用蛋白质组学技术对尿液来源干细胞的外泌体进行研究，结果表明USC-Exos能够促进糖尿病人的伤口愈合；同时研究者通过蛋白质组学分析技术对其机理进行研究，发现其中DMBT1是外泌体中主要的上调蛋白，对促进血管生成起到十分重要的作用。
1. Zhang J, Chen C, et al. Exosomes Derived from Human Endothelial Progenitor Cells Accelerate Cutaneous Wound Healing by Promoting Angiogenesis Through Erk1/2 Signaling. Int J Biol Sci. 2016; 12:1472-87.
2. Chen CY, Rao SS, et al. Exosomal DMBT1 from human urine-derived stem cells facilitates diabetic wound repair by promoting angiogenesis. Theranostics 2018; 8(6):1607-1623. doi:10.7150/thno.2295
景杰生物通过整合以组学为导向（包括基因蛋白质组学和组蛋白密码组学）的生物标志物发现、以生物标志物为导向的药物研发、以高质量抗体为基础的诊断试剂盒开发这三个环节，逐步构建起“疾病精准分层”、“精准药物研发”、“疾病精准诊断” 三位一体的精准医疗产业化发展的运作链条，从而为精准医疗产业化开创出一片广阔前景, 并开辟出一条可行路径。